Ricerca dell'Università di Kanazawa: i ricercatori definiscono un protocollo di fabbricazione di nanopipette per l'imaging cellulare ad alta risoluzione

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22 agosto 2023, 4:03 ET

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KANAZAWA, Giappone, 22 agosto 2023 /PRNewswire/ -- I ricercatori dell'Università di Kanazawa riferiscono in Analytical Chemistry come produrre nanopipette che forniscano in modo affidabile immagini al microscopio a scansione di conduttanza ionica con risoluzione su scala nanometrica di cellule viventi.

Una visione su scala nanometrica delle cellule viventi può fornire preziose informazioni sulla struttura e sulla funzione cellulare. Nel corso degli anni, sono state utilizzate varie tecniche di microscopia per ottenere una finestra sui campioni biologici su scala nanometrica, ma tutte con i loro limiti e sfide. Sebbene la microscopia a scansione di conduttanza ionica (SICM) abbia dimostrato la capacità di visualizzare campioni biologici viventi in soluzione con risoluzione su scala nanometrica, è stata ostacolata dalle sfide nella produzione affidabile di nanopipette con la geometria ottimale per il lavoro. Ora i ricercatori guidati da Yasufumi Takahashi presso la Nano LSI dell’Università di Kanazawa e l’Università di Nagoya hanno ideato un protocollo per fabbricare in modo riproducibile nanopipette con la geometria preferita per l’imaging di alta qualità. La microscopia a conduttanza ionica a scansione (SICM) utilizza una nanopipetta per controllare la distanza dei campioni nanopipetta utilizzando una corrente ionica come segnale di feedback. La forma della nanopipetta influenza in modo significativo le prestazioni del dispositivo. Ad esempio, un'ampia apertura limita la possibile risoluzione, uno shunt lungo può portare a effetti di rettifica che distorcono le misurazioni della corrente ionica e se il vetro della nanopipetta è troppo spesso può deformare il campione prima che la prossimità dell'apertura abbia raggiunto la superficie punto necessario per la mappatura topografica della corrente ionica costante. Di conseguenza, la nanopipetta ideale ha uno shunt corto, un'apertura piccola e pareti di vetro sottili.

La procedura standard per fabbricare la nanopipetta consiste nel tirare un tubo capillare con un estrattore laser che riscalda il tubo capillare che sta manipolando. Il capillare poi si restringe nei punti in cui si allunga finché non viene infine diviso in due pezzi separati. Sebbene il quarzo possa consentire un po’ più di controllo nel processo di modellazione del tubo capillare, è idrofobico, il che solleva complicazioni nel riempire effettivamente la nanopipetta con la soluzione acquosa necessaria per la corrente ionica. Per questo motivo, i ricercatori hanno sviluppato un protocollo mediante il quale poter ricavare nanopipette dai capillari di vetro borosilicato con il controllo e la riproducibilità richiesti.

Takahashi e i suoi collaboratori hanno notato che idealmente il capillare di partenza dovrebbe avere pareti spesse e un diametro interno stretto, tuttavia non è facile ottenere tubi capillari con questi requisiti da fornitori commerciali. Invece, preriscaldano il capillare per 5 s senza tirarlo, il che provoca l'ispessimento delle pareti di vetro e la riduzione del diametro interno. Hanno anche ottimizzato i parametri per tirare il tubo, come la velocità.

I ricercatori hanno dimostrato le prestazioni delle nanopipette prodotte immaginando una cellula sottoposta a un tipo di endocitosi, dove fagocita e assorbe materiale esterno. Sono stati in grado di visualizzare i microvilli – sporgenza della membrana cellulare – sulla superficie cellulare, le fosse endocitiche che si formano e la formazione di un cappuccio che chiude la fossa. I precedenti tentativi di ottenere un'immagine della formazione del cappuccio sono stati inibiti dalle limitazioni nella risoluzione spaziale.

I ricercatori sono stati anche in grado di risolvere vescicole extracellulari piccole fino a 189 nm rilasciate nel processo. Come sottolineano nel loro rapporto, vi sono prove sempre più evidenti che queste vescicole extracellulari svolgono un ruolo importante nella comunicazione tra le cellule e nell’omeostasi, con applicazioni diagnostiche e terapeutiche focalizzate in particolare sulle vescicole extracellulari più piccole tra 40 nm e 150 nm. I ricercatori concludono nel loro rapporto: "Prevediamo che questo protocollo aiuterà a fabbricare in modo riproducibile nanopipette di borosilicato per la mappatura topografica ad alta risoluzione utilizzando SICM".

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